A PrenaTest® laboratóriumi vizsgálatának menete

Németországi laboratóriumi elemzés, a német és európai jogi előírásoknak megfelelően

A PrenaTest® vizsgálat értékelése és elemzése Németországban, a Lifecodexx Konstanzban lévő diagnosztikus laboratóriumában történik, a német és európai jogszabályok és minőségi követelmények betartásával. Pácienseink egyértelmű eredményt, nem egy kockázatbecslést kapnak kézhez. A laboratóriumi vizsgálat menettét a következőkben ismertetjük:

Laborprozess_01

1. Az anyai vérmintában lévő szabad DNS kinyerése

Először elkülönítésre kerül az anyai vér plazmája centrifugálással, majd a plazmából kerül kinyerésre a szabad DNS („DNS-extractió”). Ez a szabad DNS-készlet egyaránt tartalmaz anyai eredetű szabad DNS-t (~90%-ban) és magzati eredetű szabad DNS-t (~10%-ban).

Laborprozess_02

2. A magzati eredetű szabad DNS mennyiségének, arányának meghatározása

A sikeres NIPT-analízis legfontosabb feltétele a magzati eredetű szabad DNS megfelelő aránya az anyai plazmában. A szükséges arány 4% egyes terhességben, míg 8% ikerterhességben. Ennek megfelelően a PrenaTest® következő lépése a magzati szabad DNS arányának („fetal fraction”) százalékos meghatározása az adott mintában található összes szabad DNS-hez képest. Ez a Lifecodexx által kifejlesztett ún. QuantYfeX® esszével történik. Amennyiben az arány 4% alatti, ismételt vérvétel tanácsos. (A magzati szabad DNS aránya az anyai plazmában a terhességi korral párhuzamosan növekszik.)

Laborprozess_03

3. DNS szekvenálás új generációs szekvenálással

Ahhoz, hogy képesek legyünk szekvenálni a plazmából kinyert, alapvetően kis mennyiségben jelenlévő szabad DNS fragmentumokat, először rendszerezni („genetikai könyvtár képzés”) és sokszorozni (amplifikáció) kell őket. Ezt követoen a DNS-szálak bázissorrendje dekódolásra kerül nagy teljesítményű szekvenáló gépekkel, random, párhuzamos szekvenálási technikát („random massively parallel sequencing”) alkalmazva. Minden mintából mintegy 15 millió DNS-szekvencia kerül azonosításra.

GrafikENArztbereich_Laborprozess_41_klein
Bioinformatikai analízis menete a PrenaTest® DAP.plus szoftverrel

4. Az adatok bioinformatikai analízise CE-jelzéssel ellátott PrenaTest® DAP.plus szoftverrel

A bioinformatikai analízis célja annak megállapítása, hogy az egyes vizsgált kromoszómákról (pl. 21-es, 18-as) származó DNS-fragmentumok aránya az összes kromoszómáról származó DNS-fragmentumokhoz képest különbözik-e a normálisnak tartott, euploid kromoszómakészletben mérhető aránytól. (Ha a mért arány meghaladja a normálisat, akkor triszómiára utal az eredmény, ha alatta marad, akkor monoszómiára.)
Az analízis során szigorú minőségi kritériumoknak kell megfelelnie a tesztnek: az eredetileg generált 15 millió bázisszekvenciából- a humán referencia genommal történő folyamatos összevetések után – mintegy 6 millió kerül felhasználásra a minta végső analíziséhez. Ezek a szekvenciák azok, amelyek mintánként csak egyszer találhatók meg a humán genom egy szakaszán, így 100%-ban megfeleltethetők a humán referencia genomnak („unique without mismatch”). A különböző kromoszómákat reprezentáló DNS-szekvenciák ezt követően kromoszómánként kerülnek osztályozásra (Bal oldali ábra).

 

Az analízis következő lépése az egyes kromoszómákról származó DNS-fragmentumok arányának meghatározása az összes DNS-fragmentumhoz képest, ami az ún. z-score meghatározásával történik. A z-score egy statisztikai érték, ami alkalmas annak jelzésére, ha a vizsgált minta kromoszóma-rendellenességet tartalmaz. A z-score minden mintavételt követően, az adott (vizsgált) kromoszómára nézve kerül kiszámolásra. A pozitív és negatív vizsgálati eredmények megkülönböztetésére használatos „küszöbérték” bizonyos biológiai és analítikai tényezők miatt különbözik a 21-es, 18-as és 13-as triszómiák esetén. A nemi kromoszómák számbeli eltéréseinek elemzésénél a z-score mellett egyéb értékelési tényezőket is figyelembe vesz az elemző program.

Laborprozess_05

5. A PrenaTest® eredmény közlése

A teszt utolsó lépéseként a vizsgálatot végző Lifecodexx laboratórium egy megfelelően dokumentált leletben közli a z-scoret (vagy több kromoszóma tesztelése esetén a z-score-okat), megfelelő magyarázatokkal kiegészítve az eredményt. Ennek alapján, valamint az egyéb klinikai adatokat (pl. ultrahangvizsgálati lelet) figyelembe véve, a gondozó orvos felelőssége a diagnózis felállítása és a páciens ellátása megfelelő tanácsokkal.

A z-score érték kiszámítása 21-es kromoszómára vonatkoztatva

 

Euploid genom esetén mintegy 76 000 DNS-szekvencia származik a 21-es kromoszómáról. Ezeknek az aránya a teljes genomról (az összes kromoszómáról) származó ~6 millió szekvenciára vonatkoztatva 1,27% (Lenti ábra, 1. minta). Ha a vizsgált vérminta 21-es triszómiás magzatot hordozó terhestől származik – azaz egy extra 21-es kromoszómáról is származnak DNS-fragmentumok -, akkor ez az arány 1,32% (Lenti ábra, 2. minta). A z-score kiszámításához a 21-es kromoszómára meghatározott százalékos arány összehasonlításra kerül a vizsgált mintában és a referenciaként használt, euploid mintákban. Ha az adott eredmény egy bizonyos mértéknél jobban eltér az euploid minták átlagától (a referenciacsoport átlagos abszolút deviációjában – MAD kifejezve), akkor igen nagy valószínűséggel 21-es triszómiás a vizsgált terhességben a magzat. Euploid magzatok esetén a z-score tipikusan < 3, és a z-score értékek eloszlása Gauss-féle normál eloszlást követ. Ugyanakkor, ha a z-score  3, akkor a magzat igen nagy valószínűséggel 21-es triszómiás.

 

z-score calculation of chromosome 21

A 21-es kromoszómára vonatkozó z-score értékek meghatározása euploid is triszómiás magzat esetén

 

top